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引　言

　　竹材是一種重要的生物材料。與木材相比，不僅在宏觀形態(tài)上有巨大差別，而且在微觀結(jié)構(gòu)上也表現(xiàn)出明顯的不同。竹材細(xì)胞與木材細(xì)胞一樣，都具有分層結(jié)構(gòu)，但是竹材細(xì)胞的分層結(jié)構(gòu)更為明顯而多變。壁層數(shù)量在不同竹種、不同部位有較大變異，層數(shù)最少的２～３層，最多可達(dá)１８層。由于竹子具有特殊的結(jié)構(gòu)，并具有生長迅速、強度高、柔韌性好、用途廣泛等諸多優(yōu)點，學(xué)者們很早就對竹材細(xì)胞壁產(chǎn)生了濃厚興趣，化學(xué)物質(zhì)分布就是其中一項重要的研究內(nèi)容。

    竹材細(xì)胞壁化學(xué)成分分布研究以木質(zhì)素分布為主，經(jīng)歷了從組織水平到細(xì)胞水平的發(fā)展過程。目前對不同發(fā)育階段木質(zhì)素在不同細(xì)胞組織中的沉積順序已經(jīng)有了清楚的認(rèn)識，但對單一細(xì)胞中木質(zhì)素沉積及其分布規(guī)律的認(rèn)識仍不夠深入。竹材細(xì)胞壁是由數(shù)層厚薄不同的壁層依次交替構(gòu)成。這些壁層的厚度通常較小，有的在１００ｎｍ 以下，給壁層化學(xué)物質(zhì)分布研究帶來了很大困難。傳統(tǒng)的光譜分析法如紫外分光光度計，可見光分光光度計，拉曼光譜等，由于光學(xué)衍射極限的限制，很難揭示化學(xué)物質(zhì)在這些具有納米尺度的壁層內(nèi)的分布情況。電子顯微鏡具有很高的空間分辨率，但通常需要進(jìn)行化學(xué)染色或者借助其他標(biāo)記方法如抗體標(biāo)記等才能進(jìn)行觀察，制樣復(fù)雜，操作難度大，并且易引入外部干擾因素，不能獲得原位化學(xué)分布信息。

    納米紅外技術(shù)是近幾年出現(xiàn)的一種化學(xué)分析手段。它將原子力顯微鏡和紅外光譜儀整合成為一個系統(tǒng)，利用原子力探針探測紅外吸收效應(yīng)所產(chǎn)生的熱膨脹，建立紅外波長與熱膨脹的函數(shù)關(guān)系，從而突破了傳統(tǒng)紅外衍射極限的限制，能獲取納米級的化學(xué)物質(zhì)原位分布信息。該技術(shù)最早由法國ＰａｒｉｓＳｕｄ大學(xué)ＡｌｅｘａｎｄｒｅＤａｚｚｉ博士領(lǐng)導(dǎo)的科研團(tuán)隊開發(fā)和應(yīng)用，現(xiàn)已在生命科學(xué)和材料科學(xué)中大量應(yīng)用，尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于植物細(xì)胞壁的研究。因此，本研究的目的是探討應(yīng)用納米紅外技術(shù)研究竹材細(xì)胞壁化學(xué)物質(zhì)分布的可行性，為下一步的研究工作摸索實驗技術(shù)。

1　實驗部分

1.1　材料

所用試驗材料為６年生毛竹，采自安徽黃山林場。選擇生長正常的植株，自露出地面第一節(jié)開始計數(shù)，伐倒后于第十節(jié)間中部截取厚約５ｃｍ 的竹環(huán)，保鮮膜密封，干冰儲存帶回實驗室后置于冰柜中冷凍，保存待用。

1.2　方法

1.2.1　納米紅外原理及測試方法

    本測試應(yīng)用瑞宇科技的NanoIR測試系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用側(cè)面入射光模式，脈沖激光可調(diào)范圍為９００～２０００和２２３５～３６００ｃｍ－１，光譜分辨率為４ｃｍ－１，空間分辨率為２０～１００ｎｍ。試樣截取自竹壁中部，加工成１ｃｍ×１ｃｍ×５ｃｍ的小竹塊，端部制成金字塔形，并使纖維束位于金字塔尖端。經(jīng)干燥處理后，利用鉆石刀在超薄切片機上對金字塔尖的纖維束進(jìn)行表面拋光，獲得一個平整的表面，然后進(jìn)行納米紅外測試。

1.2.2　顯微紅外測試

    取竹壁中部的竹材，加工成１ｃｍ×１ｃｍ×５ｃｍ的小竹塊，用鎢鋼刀在滑走切片上切取包含一個完整維管束，厚度為５μｍ 的竹材橫切面切片，置于兩載玻片之間自然氣干，再置于６０ ℃烘箱內(nèi)干燥１５ ｍｉｎ后，進(jìn)行顯微紅外測試。測試采用傅立葉變換顯微紅外光譜儀，將大小為２０μｍ×２０μｍ 的紅外光斑聚焦到竹材纖維細(xì)胞上，在透射模式下采集細(xì)胞壁的紅外吸收譜，掃描次數(shù)１００次。

1.2.3　拉曼光譜測試

    取竹壁中部的竹材，加工成１ｃｍ×１ｃｍ×５ｃｍ的小竹塊，用鎢鋼刀在滑走切片上切取包含一個完整維管束，厚度為１０μｍ 的竹材橫切面切片，展平于載玻片中央，蒸餾水封片后立即進(jìn)行拉曼光譜測試。為防止測試過程中水分喪失而對測試產(chǎn)生不利影響，蓋玻片四周采取樹脂涂布固封處理。

    采用共焦顯微拉曼光譜儀進(jìn)行光譜采集和掃描成像。激發(fā)光為５３２ｎｍ 可見光，物鏡采用１００倍油鏡（ＮＡ＝１．４）。掃描成像試驗參數(shù)設(shè)置為采譜曝光時間０．６６ｓ，掃描步距０．３３μｍ。木質(zhì)素分布以苯環(huán)的伸縮振動峰（１５９８ｃｍ－１）進(jìn)行成像。纖維素分布以纖維素分子鏈ＣＨ 伸縮振動峰（２８９３ｃｍ－１）進(jìn)行成像。

2　結(jié)果與討論

2.1　納米紅外光譜與顯微紅外光譜對比

    根據(jù)參考文獻(xiàn)，納米紅外光譜與傳統(tǒng)ＦＴＩＲ 紅外光譜具有很高的吻合度。但這些多是基于無機物或組成相對簡單有機物所獲得的結(jié)果。竹材細(xì)胞壁為多組分構(gòu)成的復(fù)雜有機體，情況可能會有所差別。為了驗證納米紅外的可靠性，我們首先將其與傳統(tǒng)紅外技術(shù)進(jìn)行對比。圖２和圖３分別為竹纖維的顯微紅外光譜和納米紅外光譜。紅外主要譜峰歸屬列于表１。從圖形對比來看，顯微紅外和納米紅外所獲得的譜圖存在明顯的差別，主要表現(xiàn)為顯微紅外在１０００～１１００ｃｍ－１波數(shù)范圍內(nèi)的吸收強度顯著強于其他波數(shù)范圍內(nèi)的吸收強度。而納米紅外在１７００～１７５０ｃｍ－１波數(shù)范圍具有強烈吸收，在１０００～１１００ｃｍ－１波數(shù)范圍內(nèi)的吸收強度則明顯降低。

    納米紅外是依靠原子力探針探測熱膨脹來獲得測試區(qū)域的化學(xué)信息。譜峰的吸收強度與基團(tuán)的濃度及振動能級有關(guān)?；鶊F(tuán)的振動能級越高，數(shù)量越多，其吸收強度就越大?；鶊F(tuán)的振動能級與原子折合質(zhì)量及化學(xué)鍵力常數(shù)有關(guān)，力學(xué)常數(shù)越大，折合質(zhì)量越小，則振動能級就越大。常見基團(tuán)的折合質(zhì)量和化學(xué)鍵力學(xué)常數(shù)列于表２。１０００～１１００ｃｍ－１波數(shù)范圍是Ｃ—Ｏ 基團(tuán)的特征紅外振動譜帶，１７００～１７５０ｃｍ－１波數(shù)范圍是ＣＯ 基團(tuán)的特征紅外振動譜帶。兩基團(tuán)的折合質(zhì)量相同，但ＣＯ 的力學(xué)常數(shù)為Ｃ—Ｏ 的兩倍多，因此從振動能級來看，納米紅外中ＣＯ 的吸收強度要大于Ｃ—Ｏ 的吸收強度。從基團(tuán)的濃度方面考慮，納米紅外采集的區(qū)域僅局限于針尖范圍，采樣面積小，而顯微紅外的采樣范圍數(shù)千倍于納米紅外，采樣范圍大，因此濃度差異對吸收強度的影響顯微紅外要比納米紅外小。基于以上兩個方面的原因，就出現(xiàn)了兩技術(shù)在上述波數(shù)范圍內(nèi)吸收強度的差異。但從譜峰位置來看，兩者主要譜峰位置基本重合，說明納米紅外技術(shù)能反映竹材細(xì)胞壁的基本化學(xué)信息。

2.2  納米紅外成像

    由于納米紅外光譜與傳統(tǒng)顯微紅外光譜所反映的基團(tuán)振動信息相同，因此，我們可以選擇特定的譜峰來研究化學(xué)物質(zhì)在細(xì)胞壁中的分布。１５０４ｃｍ－１為木質(zhì)素苯環(huán)的紅外伸縮振動峰，１７３２ｃｍ－１ 為碳水化合物的紅外伸縮振動峰，主要來源于半纖維素中木聚糖的伸縮振動，可以選擇這兩個紅外譜峰進(jìn)行掃描成像，分別代表木質(zhì)素和木聚糖在細(xì)胞壁中的分布，成像結(jié)果見圖４。圖４（ａ）為原子力形貌圖，清晰顯示被測細(xì)胞的形貌特征，為一兩層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，內(nèi)層寬度較大，細(xì)胞腔較小。圖４（ｂ）和圖４（ｃ）分別為該細(xì)胞木質(zhì)素和木聚糖的分布情況，顏色越紅表示紅外吸收強度越大，也反映被測物質(zhì)的分布濃度越大。從圖４（ｂ）中可以看出，木質(zhì)素在細(xì)胞角隅和復(fù)合胞間層的濃度較高，進(jìn)入次生壁后濃度減小，但在次生壁內(nèi)層中的濃度變化不大。木聚糖的分布與木質(zhì)素的分布規(guī)律相似，但在細(xì)胞角隅和復(fù)合胞間層與次生壁內(nèi)層的濃度差異更明顯［圖４（ｃ）］。

　　拉曼光譜技術(shù)是一項發(fā)展較為成熟的技術(shù)，已廣泛用于植物細(xì)胞壁的化學(xué)成分分布研究。為了與納米紅外的成像效果作對比，我們也采用拉曼光譜對竹材纖維細(xì)胞進(jìn)行了成像，結(jié)果見圖５。圖５（ａ）為測試細(xì)胞的形貌圖，細(xì)胞的層次結(jié)構(gòu)不如原子力形貌圖清晰，但可以看出明顯具有一個寬度很大的壁層。圖５（ｂ）為木質(zhì)素分布圖，成像譜峰選擇為木質(zhì)素苯環(huán)的拉曼特征峰１５９８ｃｍ－１。木聚糖的拉曼譜峰與纖維素相重疊而無法區(qū)分，無法通過拉曼光譜來研究木聚糖在纖維細(xì)胞中的分布。我們對纖維素進(jìn)行了拉曼成像。２８９３ｃｍ－１ 為ＣＨ 的拉曼伸縮振動峰，主要來源于纖維素，其在竹材細(xì)胞中的分布情況見圖５（ｃ）。從拉曼分布圖來看，木質(zhì)素也是集中分布在細(xì)胞角隅和復(fù)合胞間層，進(jìn)入次生壁后濃度減?。垡妶D５（ｂ）］。寬層內(nèi)的木質(zhì)素濃度除靠近復(fù)合丙間層的區(qū)域有明顯變化外，其他部位變化不大。值得注意的是，靠近細(xì)胞腔周圍，有兩圈木質(zhì)素分布較為集中的窄層，木質(zhì)素濃度較與其鄰近的寬層大。結(jié)合形貌圖來看，在靠近細(xì)胞腔時應(yīng)該還有兩層寬度較小的壁層。纖維素集中分布在次生壁內(nèi)，并且較均勻，在細(xì)胞角隅和復(fù)合胞間層分布較少［見圖５（ｃ）］。

　　對比納米紅外和拉曼光譜的成像，兩者所反映的木質(zhì)素的分布規(guī)律是一致的，即從細(xì)胞角隅向細(xì)胞腔方向，木質(zhì)素濃度呈減小的趨勢。但是兩者的分辨率存在一定差別，相比來說納米紅外的空間分辨率更高，能達(dá)到納米級。拉曼光譜成像在本實驗的條件下，采用５３２ｎｍ 激光為激發(fā)光源，１００倍油鏡（ＮＡ＝１．４），理論的空間分辨率為０．２３μｍ（０．６１λ／ＮＡ），設(shè)置的掃描步長為０．３３μｍ，因此實際的空間分辨率應(yīng)大于３００ｎｍ。而納米紅外根據(jù)針尖尺寸和掃描步長確定，其分辨率小于２００ｎｍ，因此在分布圖上可以發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素和木聚糖呈現(xiàn)團(tuán)聚狀不均勻的分布。

2.3　不同壁層的紅外光譜

    納米紅外的一大優(yōu)勢之一就是它可以同時獲得測試樣品表面的形貌結(jié)構(gòu)和化學(xué)信息。利用原子力顯微鏡獲得清晰的形貌圖之后，根據(jù)需要，可以將探針精確定位到感興趣的微小區(qū)域進(jìn)行納米紅外光譜采集。圖６為竹材纖維細(xì)胞多壁層結(jié)構(gòu)的納米紅外光譜原位采集試驗。圖６（ａ）為被測細(xì)胞的原子力形貌圖，粗看大約為５層結(jié)構(gòu)，其中寬度較大的兩個壁層特別易于辨認(rèn)。圖６（ｂ）為圖６（ａ）中紅色矩形所示區(qū)域的局部放大圖。通過放大圖可以將在低倍下不能觀察到的壁層清晰地顯現(xiàn)出來。這些寬度不等的壁層相互結(jié)合在一起構(gòu)成了竹材細(xì)胞特殊的多壁層結(jié)構(gòu)。我們將納米紅外光譜的采集點設(shè)置在兩層之間的交界處，如圖６（ｂ）中的彩色矩形點所示，以研究這些壁層之間的化學(xué)性質(zhì)變化。圖６（ｃ）為被測細(xì)胞的形貌示意圖，它實際為一六層結(jié)構(gòu)的細(xì)胞。圖６（ｄ）為不同壁層的納米紅外光譜。從譜圖的變化來看，大致可以分為三個不同的類別。其中細(xì)胞角隅（ＣＣ）的光譜較為簡單，譜峰較少，成為一類。第１～５層（Ｌ１～Ｌ５）譜形大致相似，可看作同一類別。相比ＣＣ 的光譜而言，在１３００～１５００ｃｍ－１波數(shù)范圍出現(xiàn)了更多的峰，表明Ｌ１～Ｌ５ 層內(nèi)的物質(zhì)組成比ＣＣ復(fù)雜。第６ 層（Ｌ６）的紅外光譜譜峰也較少，但峰特別明顯，自成一類。通過不同壁層的光譜變化可以反映，在竹材的多層結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞角隅及最靠近細(xì)胞腔的壁層與其他各層之間的化學(xué)組成是不相同的，這可能與細(xì)胞角隅及細(xì)胞腔在竹材生長過程中所擔(dān)當(dāng)?shù)墓δ芘c其他壁層不同有關(guān)，說明細(xì)胞壁的化學(xué)物質(zhì)是根據(jù)植物的生長需要而有規(guī)律的沉積。

3　結(jié)　論

　　竹材細(xì)胞壁納米紅外光譜與傳統(tǒng)顯微紅外光譜在９００～１０００ｃｍ－１波數(shù)和１６００～１７００ｃｍ－１波數(shù)范圍內(nèi)存在明顯的譜峰吸收強度差別，但兩者的譜峰位置基本相同，表明納米紅外光譜能正確地反映細(xì)胞壁的化學(xué)信息。

    納米紅外成像所揭示的木質(zhì)素分布規(guī)律與拉曼成像所反映的規(guī)律一致，但具有更高的空間分辨率，能觀察到木質(zhì)素在細(xì)胞壁中具有團(tuán)聚狀的不均勻分布。

    納米紅外能獲得清晰的樣品形貌，并能對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行精確定位和光譜采集，獲得納米級的紅外光譜，很適合用于具有納米尺度的細(xì)胞壁層的化學(xué)物質(zhì)組成和分布研究。